Метаболический топливный элемент на основе глюкозы в крови для самодостаточной биоэлектроники

Авторы: Дебасис Майти, Прит Гуха Рэй, Peter Buchmann, Майсам Мансури, Мартин Фуссенеггер

 https://doi.org/10.1002/adma.202300890

Аннотация

Доступные в настоящее время биоэлектронные устройства потребляют слишком много энергии, чтобы их можно было непрерывно использовать от перезаряжаемых батарей, и часто питаются по беспроводной сети, что приводит к проблемам с надежностью, удобством и мобильностью. Таким образом, наличие надежного, самодостаточного, имплантируемого генератора электроэнергии, который работает в физиологических условиях, будет трансформирующим для многих применений, от управления биоэлектронными имплантатами и протезами до программирования клеточного поведения и метаболизма пациентов. Здесь, используя новый медьсодержащий композит из 3D углеродных нанотрубок с регулируемой проводимостью, разработан имплантируемый метаболический топливный элемент, работающий на глюкозе в крови, который непрерывно контролирует уровень глюкозы в крови, преобразует избыток глюкозы в электроэнергию во время гипергликемии и вырабатывает достаточно энергии (0,7 МВт см^-2, 0,9 В, 50 мm глюкозы) для опто- и электрогенетической регуляции выделения везикулярного инсулина из сконструированных бета-клеток. Показано, что эта интеграция мониторинга уровня глюкозы в крови с устранением избыточного уровня глюкозы в крови путем комбинированного электрометаболического преобразования и потребления клеток, опосредованного высвобождением инсулина, позволяет метаболическому топливному элементу восстанавливать гомеостаз глюкозы в крови автоматическим, самодостаточным и замкнутым способом в экспериментальной модели диабета 1 типа.

1 Введение

Взаимосвязанные интеллектуальные электронные устройства все чаще доминируют в нашей повседневной жизни и формируют новые возможности в биомедицинских науках.^[1, 2] В то время как современные электронные носимые устройства в основном собирают и обрабатывают основные физические параметры и данные о состоянии здоровья,^[3-5] передовые исследования в области биоэлектроники показали, что молекулярные интерфейсы между клетками и электроникой в принципе могут быть встроены в биоэлектронные имплантаты, которые координируют мониторинг биомаркеров и информацию обработка с производством и высвобождением белковых терапевтических средств сконструированными клетками.^[6-8] Совместимость между биологическими и электронными системами была достигнута благодаря недавним достижениям в синтетической биологии, которые создали программируемые генетические схемы, способные реализовывать электронные принципы управления и обработки,^[9], такие как генераторы,^[10-12] аналого-цифровые преобразователи,^[13] и полу- и полные сумматоры.^[14, 15] Это позволил разработать биоэлектронные интерфейсы, программирующие поведение клеток с помощью бесследных физических сигналов, питаемых электричеством, ^[16], включая свет,^{[3, 6, 17, 18]} магнитные поля,^[19] тепло,^[20] и прямые электрические поля.^[7, 21]

Стимуляция сконструированных клеток светом,^[17] или электрическими полями,^[7, 21], которые взаимодействуют с каскадами синтетической сигнализации, контролирующими деполяризацию клеточных мембран, особенно привлекательна для биомедицинских применений, поскольку такие системы могут запускать быстрое высвобождение биофармацевтических препаратов в пузырьках в течение нескольких минут. Это важно для лечения таких заболеваний, как диабет 1 типа, которые требуют сложного динамического контроля.^[22-24] Электростимулированное быстрое высвобождение везикул достигается либо путем активации рекомбинантного меланопсина сетчатки синим светом,^[17, 22] или путем сенсибилизации клеток к электрическим полям путем совместной экспрессии управляемого напряжением канала L-типа Ca_V1.2 и выпрямляющего калиевый канал K_ir2.1 в клетках человека.^[7]

Однако, доступные в настоящее время биоэлектроника и биоэлектронные имплантаты, в частности, основанные на оптогенетике, потребляют слишком много энергии, чтобы непрерывно работать от перезаряжаемых батарей. Они должны получать беспроводное питание от генераторов экстракорпорального поля, подключенных к розетке, что ограничивает безопасность, удобство и мобильность.^{[6, 7, 21, 25]} Поэтому будущее развитие биоэлектроники и биоэлектронных имплантатов будет зависеть от наличия надежного, самодостаточного, имплантируемого генератора электрической энергии.

Циркулирующие в организме жидкости содержат множество высокоэнергетических метаболитов, которые в принципе могут быть использованы для непрерывного производства электроэнергии, необходимой для самодостаточной работы биоэлектроники. Особенно перспективным субстратом, по-видимому, является глюкоза в крови, всплески которой после приема пищи могут быть доступны для электрометаболического преобразования. Хроническая гипергликемия, связанная с сахарным диабетом, поражает более десяти процентов населения земного шара,^[26] и, следовательно, может обеспечить постоянный источник электроэнергии для биоэлектроники. Кроме того, непрерывное рассеивание избыточной метаболической энергии путем электрометаболического преобразования также может помочь в восстановлении гомеостаза глюкозы в крови.

Биотопливные элементы первого поколения, использующие глюкозу, основанные на очищенной глюкозооксидазе, действительно установили общий принцип электрометаболического преобразования,^[27-31] Однако низкая выходная мощность, ограниченный перенос электронов, низкий срок годности / полураспада фермента и биообрастание имплантированных электродов пока имеют ограниченное применение в реальном мире.^[32] Эффективность переноса электронов и проводимость были значительно улучшены путем конъюгации глюкозооксидазы с одномерными наноматериалами, такими как графен или многостенные углеродные нанотрубки (MWCNTS),^[33] но тот факт, что эти биотопливные элементы потребляли кислород, что способствует гипоксии и коррозии электродов, делает их бесполезными для клинического применения.^[34, 35] Замена глюкозооксидазы электроактивными оксидами металлов, такими как оксид меди (CuO), внедренными в 1- или 2D углеродные нанокомпозиты, действительно улучшила стабильность, срок годности и долговременную производительность, но из-за более низкой скорости переноса электронов при электрокатализе глюкозы плотность мощности этих неферментативных элементов на биотопливе глюкозы недостаточна для управления биоэлектронными имплантатами.^[36] Кроме того, использование отдельно стоящих композитов и отсутствие биосовместимого матричного материала для электродов до сих пор препятствовали разработке клинических применений неферментативных клеток на биотопливе.^[33, 37-39] Однако гибридные ферментативные биотопливные элементы недавно показали многообещающую производительность. Например, производство биотопливных элементов на основе металлических хлопковых волокон, покрытых глюкозооксидазой (GOx), или углеродной ткани с содержанием GOx (CC), обеспечивало плотность мощности (PD) 3,7 МВт / см ^-2 и 1,07 МВт/ см^-2 в 300 м м и 100 мм растворе глюкозы соответственно.^[40, 41] Кроме того, GOx также наносили на сшитые УНТ для достижения PD 0,94 МВт/ см^-2 в 200 мм растворе глюкозы при насыщении O₂.^[42] В параллельном исследовании загруженный GOx органический металлический композит на основе CNT-Ag / нафталинтиола обеспечивал выходную мощность 1,46 МВт / см^-2 в присутствии 400 мм глюкозы.^[43] Тем не менее, эти ферментативные биотопливные элементы работают только при концентрации глюкозы 100 мм или выше, что значительно выше физиологической концентрации глюкозы даже при диабете.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали иерархически оформленную трехмерную матрицу из CuO-MWCNTs и композита поли (3,4-этилендиокситиофен)-поли (стиролсульфонат) (PEDOT: PSS) (CuO-MWCNTs-PEDOT: PSS) и изготовили метаболический топливный элемент без медиаторов, который постоянно контролирует уровень глюкозы в крови, вырабатывает электричество исключительно во время гипергликемии и вырабатывает достаточно электроэнергии для питания и управления биоэлектронными имплантатами на основе оптогенетических и электрогенетических технологий. Программируя эти биоэлектронные имплантаты для быстрого высвобождения инсулина из сконструированных клеток человека с использованием оптогенетических или электрогенетических интерфейсов, мы создали системы метаболического контроля с замкнутым контуром, которые могут автономно восстанавливать гомеостаз глюкозы при экспериментальном диабете 1 типа.

2 Результат

Концепция метаболического топливного элемента

Мы разработали имплантируемый метаболический топливный элемент, который подключается к энергетическому метаболизму млекопитающих, катализируя превращение избыточной глюкозы в крови в неинсулиногенный глюконат, секретируемый почками, высвобождая электрон и преобразуя метаболическую энергию в электрическую энергию (рисунок 1). Схема управления электрическим питанием постоянно контролирует уровень глюкозы в крови и подключает метаболический топливный элемент к носимым и мобильным устройствам для связи, записи и внешней настройки. Его маломощное зарядное устройство и конденсатор, заряжаемые во время гипергликемии, обеспечивают более 4 вольт, что достаточно для обеспечения электрогенетического и оптогенетического контроля производства биофармацевтических препаратов с помощью имплантированных инженерных клеток человека (рисунок 1). Подключение метаболического топливного элемента к электро- или оптогенетической выработке инсулина с помощью сконструированных клеток человека создает замкнутую схему управления, в которой метаболический топливный элемент включается во время гипергликемии и запускает электро- или оптогенетическое быстрое высвобождение инсулина. Комбинированный эффект потребления глюкозы метаболическим топливным элементом и поглощения глюкозы клетками, опосредованного высвобождением инсулина, восстанавливает гомеостаз глюкозы в крови, который отключает метаболический топливный элемент для предотвращения гипогликемии (рисунок 1). Поскольку уровень глюкозы в крови сам регулирует накопление заряда метаболического топливного элемента, контроль диабета достигается полностью автономным, самодостаточным и бесперебойным образом (рисунок 1).

В метаболическом топливном элементе используются гибкие соединенные электроды, собранные путем 3D-монолитного объединения различных наноматериалов. Анод состоит из гибкого графитового войлока, обеспечивающего 3D-поддержку пространственно оформленного комплекса CuO-MWCNTs-PEDOT:PSS. В то время как переход CuO из Cu(II) в Cu(III) катализирует окисление глюкозы в глюконат, многостенные углеродные нанотрубки захватывают, удаляют и транспортируют полученный электрон, поддерживаемый проводящим наполнителем, PEDOT: PSS (рисунки 1, 2A). Катод состоит из гибкого CC, обеспечивающего 3D-поддержку наночастиц платины, декорированных сажей (CB) (PtNP), которые покрыты нафионом для максимального и селективного использования протонов при окислении глюкозы в глюконат на основе анода, что позволяет катализируемой платиной реакции протонов с кислородом с образованием H₂O, таким образом, замыкая электрический цикл метаболического топливного элемента (рисунки 1, 3A). ).

Характеристика и валидация анода

Морфологический анализ анода с помощью полевой эмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FESEM) (рис. 2A-i,ii) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM) подтвердил трехмерную структуру, состоящую из MWCNTs (шириной≈30 нм), гомогенно покрытых мелкими агрегатами наночастиц CuO (диаметром≈50-150 нм) и заполненных проводящим PEDOT:PSS (рис. 2A-iii,iv). Π–π взаимодействия между MWCNTs и PEDOT: PSS используют электроны от CuO-опосредованного превращения глюкозы в глюконат и улучшают передачу заряда через весь анод к катоду без необходимости в каком-либо посреднике (рисунок 2A-iv). Анод был стабильным с течением времени, и никаких изменений в морфологии 3D нанокомпозита не наблюдалось даже после 60 дней непрерывного использования, что свидетельствует о том, что материал достаточно прочный при работе в имплантируемом метаболическом топливном элементе (рисунок 2A-v, vi).). Пики рентгеновской дифракции соответствуют пикам стандартной моноклинно-фазовой структуры оксида меди (CuO) (карточка JCPDS № 48-1548) (рисунок S1, вспомогательная информация).

Электрохимическая характеристика анодного нанокомпозита показала четкий набор окислительно-восстановительных пиков для CuO-MWCNTs и CuO-MWCNTs-PEDOT: PSS; эти пики отсутствовали в первичных MWCNTs, что указывает на то, что наночастицы CuO действительно генерируют окислительно-восстановительный потенциал (рисунок 2B).). Кроме того, графики импеданса Найквиста, проанализированные с помощью модифицированной эквивалентной схемы Рэндла, показали, что CuO сдерживает передачу электронов в MWCNT, поскольку сопротивление переносу заряда (R_ct) исключительно увеличивалось, когда MWCNT были украшены наночастицами CuO (CuO-MWCNT) (рисунок 2C).). Этот эффект был компенсирован за счет проводящего наполнителя PEDOT: PSS, который существенно уменьшил общую R_ct анодного нанокомпозита CuO-MWCNTs-PEDOT: PSS (рисунок 2C; Рисунок S2, вспомогательная информация). Пиковый ток увеличивался с более высокими скоростями сканирования, а анодный пиковый (I_ПА) и катодный пиковый (I_ПК) токи были прямо пропорциональны квадратному корню из скорости сканирования, что указывает на то, что глюкоза свободно диффундирует по всему метаболическому топливному элементу (рисунок 2D, E).

Амперометрическое измерение уровня глюкозы подтвердило, что анодный нанокомпозит обладает высокой чувствительностью к глюкозе и полностью работоспособен в диапазоне физиологического уровня глюкозы в крови человека от 5 м м до 50 м м (Рисунок 2F; Рисунок S3, вспомогательная информация).

Характеристика и валидация катода

Катод метаболических топливных элементов был изготовлен путем химического осаждения PtNP на поверхность из углеродной сажи (CB) с последующим равномерным покрытием Nafion (рисунок 3A).). Нафионовое покрытие электрода PtNP-CB обеспечивает исключительный перенос протонов к катоду, где они вступают в реакцию с PtNP в присутствии кислорода с образованием H₂O. Кроме того, Nafion эффективно защищает электрод от загрязнения, что обеспечивает непрерывное использование, увеличивает срок службы и делает метаболический топливный элемент биосовместимым для имплантации. Обычные платиновые катоды, используемые для классических биотопливных элементов на основе ферментов, окисляются в присутствии радикалов ОН^-, что приводит к созреванию по Оствальду и загрязнению электрода, что резко сокращает срок службы и препятствует непрерывной работе имплантата.^[40]

Морфологический анализ катода с помощью полевой эмиссионной сканирующей микроскопии (FESEM) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM) подтвердил трехмерную структуру катодного нанокомпозита (рисунок 3A), в частности отчетливое и равномерное оформление PtNP (рисунок 3A-i,ii) (диаметром 2-5 нм) на поверхности CB (ширинойоколо100 нм), а также однородную поверхность Nafion и покрытия пересечения PtNP-CB (рисунок 3A-iii,iv). Катод был стабильным в течение по меньшей мере 60 дней без видимых морфологических изменений 3D нанокомпозита, что указывает на то, что материал достаточно прочный для работы в имплантируемом метаболическом топливном элементе (рисунок 3A-v,vi).). Важно отметить, что Nafion увеличивает силу сцепления между PtNP и CB, а также повышает долговечность катода за счет повышения потенциала восстановления кислорода, тем самым защищая метаболический топливный элемент от биообрастания в жидкостях организма.

Циклическая вольтамперометрия (CV) катода показала, что Nafion снижает скорость переноса электронов, и что PtNP-покрытие нанокомпозита PtNP-CB компенсирует этот эффект (рисунок 3B). Аналогичным образом, измерения импеданса подтвердили, что PtNP компенсировал снижение сопротивления передаче заряда (R_ct), вызванное слоем нафиона (рисунок 3C; Рисунок S2, вспомогательная информация). Нафион не только служит протоноселективной мембраной катода, он также существенно увеличивает общую производительность, срок годности и долговечность метаболического топливного элемента (рисунок 3A-v,vi). Измерения циклической вольтамперометрии (CV) подтвердили, что токи катодного пика (I_ПК) и анодного пика (I_ПА) были линейно связаны с квадратным корнем из скорости сканирования (рисунок 3D), что указывает на свободную диффузию глюкозы по всему метаболическому топливному элементу (рисунок 3E). Циклическая вольтамперометрия (CV) также подтвердила способность катода эффективно переносить электроны для преобразования протонов и кислорода в H₂O (рисунок 3F).

Производительность метаболического топливного элемента

Сборка анода и катода обеспечила метаболический топливный элемент, который можно было подключить к энергетической системе млекопитающих для эффективной выработки электроэнергии в пределах физиологического диапазона уровня глюкозы в крови 4-50 м м (рисунок 4A-D). Действительно, базовый метаболический топливный элемент показал увеличение PD и напряжения разомкнутой цепи (OCV) с увеличением уровня глюкозы в крови (рисунок 4A-D), что соответствует или превосходит производительность обычных нефизиологических биотопливных элементов, которые, что критически важно, не являются ни биосовместимыми, ни имплантируемыми. Аналогично, общая плотность тока (CD, мА см^-2) также значительно увеличивается в условиях гипергликемии (рисунок 4C). Таким образом, в принципе, метаболический топливный элемент должен быть способен генерировать достаточное количество электрической энергии (0,45 МВт см^-2 (PD), 0,6 В (OCV) или 3,6 мА см^-2 (CD)) из глюкозы в крови (10 мм) для питания кардиостимуляторов (~ 10-20 мкВт),^[44] или для освещения светодиодов для оптогенетики (~ 4,6 мкВт).^[ 45]

Помимо использования глюкозы в крови в диапазоне физиологических концентраций в качестве источника метаболической энергии, имплантированный метаболический топливный элемент должен работать в сложной тканевой среде со строго контролируемыми физическими (температура тела 37 ° C) и химическими параметрами (ионная проводимость жидкостей организма, таких как сыворотка, рН 7,4). Действительно, мы обнаружили, что метаболический топливный элемент вырабатывал достаточную энергию при 10 м м глюкозы (рисунок 4E–H) в ионных жидкостях организма (рисунок 4E), а также при физиологическом рН (рисунок 4F) и температуре (рисунок 4G), для загрузки - запустите усилитель малой мощности с одновременным усилением выходного сигнала. Производительность, стабильность и надежность метаболического топливного элемента оценивались в течение месяца непрерывного использования в физиологических условиях (10 м м глюкозы, 37 ° C, pH 7,4) (рисунок 4H), в течение которого устройство поддерживало до 70% своей первоначальной производительности. Кроме того, производительность может быть восстановлена до 93% простым мытьем и нагревом устройства, что указывает на то, что его можно будет использовать повторно (рисунок S4, вспомогательная информация). Учитывая, что реальные биомедицинские приложения потребовали бы прерывистой работы, а не непрерывного использования, можно ожидать, что практический срок службы будет еще больше.

Управление напряжением метаболических топливных элементов

Чтобы максимизировать программируемую выходную мощность для различных применений, метаболические топливные элементы могут быть либо расположены последовательно и / или параллельно, либо оснащены схемой управления питанием, содержащей усилитель малой мощности, подключенный к конденсатору (таблица S1, вспомогательная информация),^[46, 47].Поэтому мы соединили базовые метаболические топливные элементы в различных конфигурациях (два или четыре последовательно, два последовательно и два параллельно) и профилировали OCV, а также общий CD в присутствии 10 мм глюкозы (рисунок 4I,J). В то время как конфигурация с четырьмя последовательно расположенными элементами обеспечивала самое высокое напряжение OCV (1,65 В; Рисунок 4I; Таблица S1, вспомогательная информация) и непрерывно поддерживали 95% этого значения в течение более 30 часов (рисунок S5, вспомогательная информация), четыре последовательно расположенных в двух параллельных конфигурациях обеспечивали наибольшее общее количество CD (20,71 млн см^-2, рисунок 4J; Таблица S1, вспомогательная информация). Параметры производительности всех протестированных конфигураций метаболических топливных элементов выгодно отличаются от описанных неферментативных биотопливных элементов на глюкозе и, по-видимому, хорошо подходят для питания биоэлектронных устройств (таблица S1, вспомогательная информация).). Однако, поскольку имплантаты, сочетающие в себе несколько метаболических топливных элементов, слишком велики для реального клинического применения, мы подключили один метаболический топливный элемент к схеме управления питанием, состоящей из маломощного зарядного устройства, собирающего вырабатываемую глюкозой электроэнергию исключительно во время гипергликемии, и заряжающего конденсатор (330 мкФ), обеспечивающий пиковое напряжение более 4 Вольт (рисунок 4K; Рисунок S6, вспомогательная информация).

Характеристика имплантированных метаболических топливных элементов In Vivo

Чтобы проверить базовый метаболический топливный элемент in vivo, мы имплантировали устройство мышам с диабетом 1 типа и профилировали полученный OCV (0,42 В) (рисунок 4L).). В то время как метаболический топливный элемент генерировал только половину своего PD in vitro при имплантации, OCV снизился всего на 15% (рисунок 4L). Снижение производительности имплантированных метаболических топливных элементов может быть связано с более низкой ионной проводимостью в ткани, а также с возможными помехами из-за фиброза. Однако общая мощность 0,241 МВт/см ^-2 является самой высокой на сегодняшний день для имплантированного неферментативного метаболического топливного элемента. При эксплантировании и восстановлении путем промывки производительность метаболических топливных элементов увеличилась более чем на 100% по сравнению с эксплуатацией in vivo, что подчеркивает стабильность, надежность и долговечность устройства (рисунок 4L). Чтобы подготовить метаболический топливный элемент для терапевтических применений in vivo и улучшить его биосовместимость, мы покрыли его глубоким слоем альгината, лицензированного FDA. Это существенно не изменило его ключевые показатели производительности (рисунок S7, вспомогательная информация).

Контроль по замкнутому циклу экспериментального диабета 1 типа с помощью имплантированного метаболического топливного элемента, стимулирующего быструю секрецию инсулина, вызванную электрическим полем

Недавно мы установили, что клетки человека, сконструированные для эктопической совместной экспрессии канала Са _V1.2, управляемого напряжением L-типа, и выпрямляющего калиевого канала K_ir2.1 в клетках человека (_{Электро}β), быстро высвобождают инсулин в ответ на деполяризацию мембраны, стимулируемую электрическим полем.^[7] Чтобы подтвердить автономный контроль стимулируемого электрическим полем высвобождения инсулина метаболическим топливным элементом, работающим на глюкозе в крови, для контроля гликемии с замкнутым контуром, мы имплантировали метаболический топливный элемент, подключенный к _{электро}-β-клеткам, мышам с диабетом 1 типа (рисунок 5A,B).

Метаболический топливный элемент был способен генерировать 4,2 В, что стимулировало быструю везикулярную секрецию инсулина в течение нескольких минут (рисунок 5C). Поскольку для контроля гликемии требуются повторные инъекции инсулина всякий раз, когда уровень глюкозы в крови повышается, метаболический топливный элемент должен повторно создавать стимулирующие электрические поля с соответствующими интервалами. Метаболический топливный элемент действительно способен приводить в действие повторяющиеся стимуляции секреции инсулина, вызванные гипергликемией, с аналогичной кинетикой высвобождения и конечными дозами инсулина, подтверждая, что устройство перезаряжает свою мощность и _{Электро}β-клетки пополняют свои пузырьки для хранения инсулина в соответствующие сроки, чтобы запрограммировать терапевтические дозы инсулина (рисунок 5D). Эта синхронная обратимость имплантированного метаболического топливного элемента и _{электро}-β-элементов является необходимым условием для установления контроля замкнутого цикла при лечении диабета 1 типа (рисунок 5D).

Имплантация метаболического топливного элемента, подключенного к подкожным микрокапсулированным _{электро}-β-клеткам, мышам с диабетом 1 типа, действительно установила замкнутый контур контроля уровня глюкозы в крови, объединяющий выработку энергии на основе глюкозы, вызванную гипергликемией, метаболическим топливным элементом с быстрой секрецией везикулярного инсулина, стимулируемой электрическим полем, для поддержания гомеостаза глюкозы в крови в режиме реального времени (рисунок 5E-H). У мышей с диабетом 1 типа уровень инсулина в крови достиг максимума всего за 30 минут (рисунок 5E), восстанавливая уровень глюкозы в крови до уровня дикого типа без превышения гипогликемии (рисунок 5F). Стабильные уровни инсулина дикого типа (рисунок 5G) и глюкозы в крови (рисунок 5H) поддерживались при повторном ежедневном кормлении в течение более длительных периодов времени. Важно отметить, что схема управления питанием метаболического топливного элемента выпускает напряжение только для стимуляции _{электро}β выше порогового потенциала 330 мВ, достигнутого при уровне глюкозы в крови выше 10 мм. Метаболический топливный элемент прекращает катализировать выработку электроэнергии на основе глюкозы, как только достигается нормогликемия (<10 мм глюкозы), тем самым предотвращая гипогликемию (рисунок 5H). Как только концентрация глюкозы превысит 10 мm, ячейка на биотопливе глюкозы генерирует выходное напряжение выше 330 мВ, которое активирует схему управления питанием (PMC) и выдает выходное напряжение 4,2 В. Как только оно падает ниже 10 мм, PMC деактивируется / выключается, чтобы остановить процесс стимуляции.

Контрольное лечение экспериментального диабета 1 типа с помощью имплантированного метаболического топливного элемента, стимулирующего быструю секрецию инсулина, вызванную светом

Большинству биоэлектронных имплантатов, предназначенных для биомедицинских применений, в частности, основанных на оптогенетике, потребуется больше энергии, чем требуется для стимуляции электрическим полем _{электро}β-клеток.^{[6, 18, 25, 48]} Чтобы проверить метаболический топливный элемент для оптогенетики, мы использовали его для питания подсветки синим светом клеток iβ, которые представляют собой бета-клетки поджелудочной железы человека, сконструированные для стимулируемая синим светом везикулярная секреция инсулина, запускаемая меланопсином, связанным с рецептором, связанным с G-белком сетчатки (GPCR) (рисунок 6A).^[17] Имплантированный метаболический топливный элемент использовался для включения светодиода, излучающего синий свет, во время гипергликемии; светодиод освещает подкожные микрокапсулированные клетки iβ для координации быстрого высвобождения везикулярного инсулина по замкнутому циклу (рисунок 6B). Напряжение 4,2 В, генерируемое метаболическим топливным элементом, действительно было способно питать светодиод и запускать быстрое (в течение нескольких минут; Рисунок 6C) и повторное (рисунок 6D) выделение везикулярного инсулина из клеток iβ.

Затем мы имплантировали метаболический топливный элемент, соединенный с микрокапсулированными клетками iβ мышам с диабетом 1 типа, чтобы установить замкнутый контур контроля уровня глюкозы в крови. Выработка электроэнергии на основе глюкозы, вызванная гипергликемией, с помощью метаболического топливного элемента была успешно интегрирована со стимулируемой синим светом быстрой секрецией везикулярного инсулина для поддержания гомеостаза глюкозы в крови в режиме реального времени (рисунок 6F-H). У мышей с диабетом 1 типа уровень инсулина в крови достиг максимума всего за 30 минут (рисунок 6E), восстанавливая уровень глюкозы в крови до уровня дикого типа (рисунок 6F). Стабильный инсулин дикого типа (рисунок Уровни 6G) и глюкозы в крови (рисунок 6H) поддерживались при повторном ежедневном кормлении в течение более длительных периодов времени. Синяя подсветка включается только тогда, когда метаболический топливный элемент питается при уровне глюкозы в крови выше 10 мкл м глюкозы, что соответствует пороговому напряжению 330 мВ, предотвращая гипогликемию (рисунок 6H).

3 Заключение

Носимые и имплантируемые электронные устройства становятся все более мощными для мониторинга физиологической информации на месте и предоставления информации для медицинских вмешательств в режиме реального времени.^[36, 49-51] Недавняя разработка биомолекулярных датчиков и дизайнерских клеток, обрабатывающих и передающих физиологическую информацию электронным устройствам, а также электронным устройствам, программирующим высвобождение биофармацевтических препаратов в клетках в ответ на свет,^[17] или прямые электрические поля,^{[7, 21, 52]} привел к созданию электрогенетических интерфейсов, которые обеспечивают обратимую связь между биологией и электроникой,^[36, 53], вызвав видение новых методов лечения на основе биоэлектронных имплантатов.^[54, 55] Независимо от того, используют ли такие биоэлектронные устройства и имплантаты свет в качестве посредника для электрогенетического контроля,^{[7, 17 , 18]} или прямые электрогенетические интерфейсы на основе электрических полей,^[21] все они требуют значительной электрической энергии для поддержки мониторинга, обработки и связи.^[32] Таким образом, доступные в настоящее время биоэлектронные имплантаты не могут работать от батареи, но требуют проводного,^[18] или беспроводного питания,^[6, 7] для непрерывной работы, что ограничивает самодостаточность, надежность и удобство для пациента. В идеале было бы предпочтительнее управлять биоэлектронными имплантатами с использованием эндогенного источника питания для самодостаточной, непрерывной и надежной работы. В принципе, жидкости организма содержат достаточное количество избыточной метаболической энергии в виде жирных кислот,^[56] и глюкозы,^[57], который можно использовать для питания биоэлектронных имплантатов, а также носимых электронных устройств. Поскольку метаболизм жирных кислот функционально связан с выработкой глюкозы посредством глюконеогенеза.^[58, 59] а уровни глюкозы часто повышаются и резко возрастают из-за привычек питания и образа жизни в промышленно развитых странах или хронически повышаются при диабете, который поражает более 10% мирового населения,^[60, 61] избыток сахара в крови может быть оптимальным метаболическим источником энергии для питания биоэлектронных имплантатов.

Идеальный метаболический топливный элемент, работающий на глюкозе, должен вырабатывать высокий уровень электроэнергии при гипергликемии, когда концентрация глюкозы в крови превышает 10 мм. Биотопливные элементы первого поколения на глюкозе требовали глюкозооксидазы для каталитического расщепления глюкозы до глюконата для генерации электронов в качестве источника электроэнергии.^[30, 62] Хотя за последнее десятилетие в биотопливных элементах на основе глюкозы на основе ферментов произошли впечатляющие улучшения, повысившие эффективность выработки электроэнергии до оОКВ почти 800 мВ, ограниченный срок годности ферментов и необходимость концентрации глюкозы на два порядка выше физиологического уровня сахара в крови препятствовали любому биомедицинскому применению. Типичные результаты включают: >300 мм глюкозы, 298 мВ;^[63] >300 мм глюкозы, 370 мВ;^[40] 1 м глюкозы, 750 мВ;^[64] 200 мм глюкозы, 360 мВ;^[65] 170 мм глюкозы, 770 мВ.^[66 ]

Клетки на биотопливе из глюкозы второго поколения заменили глюкозооксидазу металлоорганическими каркасами (MOF), содержащими мезопористый CuCo₂O₄ (100 мм глюкозы, 850 мВ),^[67] углеродные нанотрубки, украшенные нанододекаэдрами Co₃O₄ (100 мм глюкозы, 298 мВ),^[68] графеновые нанолистовые пластины, украшенные оксидом никеля (100 мм глюкозы, 750 МВт),^[69] или керамикой из оксида церия (500 мм глюкозы, 110 мВ).^[70] Хотя замена глюкозооксидазы оксидами металлов была важным шагом в повышении стабильности и долговечности клеток, работающих на биотопливе глюкозы, их потребность в уровнях глюкозы, на порядки превышающих физиологический диапазон, и их негибкая жесткая структура делают их несовместимыми с биоэлектронными имплантатами и биомедицинскими приложениями. Параметры производительности недавно разработанных ферментативных и неферментативных биотопливных ячеек на глюкозе сравниваются в таблице S2, содержащей вспомогательную информацию.

Здесь, интегрируя иерархически оформленный гибкий 3D-наноструктурированный неорганический CuO-катализатор, мы изготовили метаболический топливный элемент, генерирующий OCV более 330 мВ при физиологических концентрациях глюкозы в крови. Эффективное преобразование метаболической энергии в электрическую обеспечивается нанокаталитическим CuO, который превращает глюкозу в глюконат и генерирует протоны, одновременно перенося полученные электроны путем баллистического переноса через магистраль MWCNT, когерентно поддерживаемую проводящим наполнителем PEDOT: PSS. Этот наполнитель взаимодействует со свободными π-электронами на стенках MWCNT, приводя к π–π сопряжению, при котором олигополимеры PEDOT образуют проводящие кластеры, выровненные с цепями PSS, тем самым формируя локализованные проводящие зерна, которые увеличивают баллистический перенос электронов. Полученный метаболический топливный элемент не только эффективно определял уровень глюкозы во всем физиологическом диапазоне уровня глюкозы в крови, но также сохранял свою производительность и стабильность в течение длительных периодов времени. Использование электронов путем каталитического распада глюкозы на аноде сочеталось с умным катодом из нанокомпозита без медиаторов, покрытого нафионом, где входящие протоны служат для восстановления кислорода до H₂O. Трехмерная архитектура метаболического топливного элемента увеличивает площадь реакции и максимизирует эффективность захвата электронов и пропускную способность.

В то время как современные лекарственные препараты представляют собой системы управления с разомкнутым контуром, для которых врачи обычно назначают несколько таблеток для приема несколько раз в день в зависимости от веса тела пациента,^[71, 72] большинство метаболических процессов поддерживаются на гомеостатическом уровне с помощью замкнутых контуров, в которых обратная связь на выходе управляет входом. Например, гомеостаз глюкозы в крови в основном контролируется бета-клетками поджелудочной железы, которые постоянно контролируют уровень сахара в крови.^[73] Бета-клетки обнаруживают постпрандиальные скачки уровня глюкозы в крови и выделяют инсулиногенные пептидные гормоны, такие как инсулин, который способствует усвоению глюкозы клетками и восстанавливает гомеостаз глюкозы в крови. Включение схемы управления питанием в метаболический топливный элемент не только повысило OCV до уровня, необходимого для питания биоэлектронных устройств, таких как быстрое выделение везикулярного инсулина с помощью прямого электрического поля, стимулируемого_{Электро}β-элементы (1 В) или стимулируемые синим светом iβ-клетки (3 В), но также позволяли топливному элементу стимулировать электро- или оптостимулированное высвобождение инсулина имплантированными дизайнерскими клетками исключительно в условиях гипергликемии, когда OCV поднимался выше 330 мВ. Таким образом, метаболический топливный элемент ведет себя подобно бета-клетке человека, постоянно контролируя уровень глюкозы в крови и стимулируя быстрое выделение инсулина клетками во время гипергликемии для восстановления гомеостаза глюкозы в крови. Тот факт, что метаболический топливный элемент обеспечивает эффект снижения уровня глюкозы за счет сочетания стимуляции высвобождения инсулина и потребления глюкозы для производства электроэнергии, позволяет поддерживать гомеостаз глюкозы при более низких уровнях инсулина, что было бы терапевтически актуально, особенно в случаях резистентности к инсулину.^[74, 75]

В этой работе мы проверили наш полностью интегрированный, имплантируемый неферментативный метаболический топливный элемент на основе глюкозы для замкнутого электро- и оптогенетического контроля доставки инсулина и подтвердили, что он может восстанавливать и поддерживать гомеостаз глюкозы при экспериментальном диабете 1 типа. Можно ожидать, что наличие метаболических топливных элементов, преобразующих избыточную метаболическую энергию в электроэнергию в физиологических условиях, откроет много новых возможностей для применения биоэлектронных имплантатов, а также носимых электронных устройств.

4 Экспериментальная секция

Реагенты и материалы для изготовления и характеристики метаболического топливного элемента и силовой схемы

Акриловая кислота (C₃H₄O₂), хлороплатиновая кислота (H₂PtCl₆), дигидрат хлорида меди (CuCl₂^.H₂O), глюкоза, гидрохлорид гидроксиламина (NH₂OH^.HCl), раствор Нафиона 117 (кат. № 70160, C₇HF₁₃ O₅S^.C₂F₄), N-гидроксисукцинимид (NHS, C₄H₅NO₃), фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS, кат. № P5493), N,N'-бис(акрилоил) цистамин (BAC, C₁₀H₁₆N₂O₂S₂), полицеллюлоза ([C₁₂H₂₀O ₁₀]_n), борогидрид натрия (NaBH₄), додецилсульфат натрия (SDS, NaC₁₂H₂₅SO₄), 1-этил-3-(-3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC, C₈H₁₇N₃), 2,2'-азобис (2-метилпропионамидин) дигидрохлорид (AAPH, C₈H₂₀Cl ₂N₆) и PEDOT: PSS были приобретены у Sigma-Aldrich. Ацетон, CB, этанол, гидроксид калия (KOH) и гидроксид натрия (NaOH) были приобретены у ThermoFisher Scientific. MWCNTs, функционализированные группами COOH, были приобретены у Nanocyl Inc. (кат. № 7000). Все реагенты использовались в том виде, в каком они были получены, без дополнительной очистки. Изолирующий медный провод и серебряные чернила (кат. № 186-3600) были приобретены у RS Components. Графитовый войлок (GF) (cat. № G100) был приобретен в магазине Fuel Cell. Биоклей (кат. номер: BG3510-5-US) был приобретен у CryoLife Inc. У Digi-Key Inc. было приобретено зарядное устройство с низким энергопотреблением BQ25504 (Texas Instruments), а конденсатор емкостью 330 мкФ (Panasonic, танталовый конденсатор; кат. № 10TPB330M) - у Distrelec.

Изготовление конструкции анода Метаболического топливного элемента

CuO получали путем смешивания 1,5 г додецилсульфата натрия (SDS) с 200 мл ddH₂O при перемешивании (1 ч, 200 об/мин, 50°C) с последующим последовательным добавлением 100 мл смеси в соотношении 1:1 по объему 0,2 м CuCl₂^.H₂O и 0,5 м KOH, а также 10 мл 0,2 м гидроксиламина гидрохлорида при перемешивании в течение еще 4 ч при 200 об/мин и 140°C. Осадок CuO промывали пять раз ddH ₂O центрифугированием в течение 5 мин при 8000× g и высушивали в течение ночи при 180 °C.^[76] Затем 100 мг CuO и 10 мг MWCNTs добавляли к 10 мЛ раствора PEDOT:PSS (10% в/в растворяли в ДМСО с помощью обработки ультразвуком в ванне (Bioruptor, Diagenode), перемешивали (30 мин, 200 об/мин, 30°C) и обрабатывали зондом ультразвуком в течение 10 мин (82% амплитуда, 20 кГц, 250 Вт, 5 с циклов включения/выключения; Sonopuls HD4100, Bandelin Electronic GmbH) для получения гомогенного раствора CuO-MWCNTs-PEDOT:PSS. Для изготовления анода 1 см² GF (промывают 5 раз в 75% этаноле, промывают 5 раз в ddH₂O, высушенные при 60 ° C в течение ночи) были покрыты раствором CuO-MWCNTs-PEDOT: PSS и высушены в течение 2 ч при 150 ° C четыре раза подряд для получения однородного покрытия.

Конструкция катода

Украшенный PtNP CB (PtNP-CB) был получен путем первого растворения 1 мг мЛ^-1 порошка CB (CB) в 100 мл 75% этанола при перемешивании (30 мин, 300 об/мин, 40 °C) с последующим последовательным добавлением 50 мл хлороплатиновой кислоты (1 мг мл^-1 в ddH₂O) при перемешивании (4 ч, 300 об/мин, 80°C) и добавлением по каплям 5 мл 0,1 м NaBH₄ при перемешивании в течение 30 мин при 300 об/мин и 80 °C. Осадок PtNP-CB промывали пять раз ddH ₂O центрифугированием в течение 5 мин при 8000× g и сушили в течение 4 ч при 120 °C. Для изготовления катода требуется 1 см² куб.см (промывают 5 раз в пропаноле, промывают 5 раз в ddH₂O, высушенный в течение ночи при 60 ° C) был покрыт раствором PtNP-CB и высушен в течение 2 часов при 60 ° C четыре раза подряд для получения однородного покрытия. Затем раствор Нафиона 117 наносили каплями на CC, покрытый PtNP-CB, и нанесение нафионового покрытия на PtNP-CB повторяли еще четыре раза перед сушкой катода в течение ночи при 60 °C.

Сборка

Анод и катод были соединены тонкими изолированными медными проводами с использованием серебряных чернил и биоклея для герметизации и защиты. Аноды и катоды были разделены и упакованы в мешок из полицеллюлозной мембраны, который был запечатан биоклеем.

Инкапсуляция Метаболического топливного элемента

Для защиты и изоляции метаболического топливного элемента от тканевой среды он был инкапсулирован в клинически лицензированный альгинат. Метаболический топливный элемент был упакован в целлюлозную диализную мембрану и дополнительно покрыт альгинатным гидрогелем, который является биосовместимым биоматериалом, лицензированным FDA, используемым во многих исследованиях на животных для подтверждения концепции^{[7, 17, 77-79]}, а также в клинических испытаниях на людях (ClinicalTrials.gov например, NCT01379729, NCT00790257, NCT01739829).^[80] Альгинатную оболочку получали путем растворения 1.6 г альгината (кат. № 11061528; Büchi AG) в 100 мЛ водного раствора, содержащего 3% мас./мас. акриловой кислоты, 0,01% мас./мас. N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BAC) и 0,05% мас./мас. 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорида (AAPH), перемешивают (30 мин, 300 об/мин, 60°C) и добавляют по каплям 10 мл водного раствора, содержащего 5 мл 1 % в/в 1-этил-3-(-3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и 5 мл 0,5% в/в N-гидроксисукцинимида (NHS). Метаболический топливный элемент был покрыт глубоким слоем путем погружения сначала в полученный раствор альгината на 1 час, а затем еще на час в 0,1м водного раствора хлорида кальция для придания альгинату гелеобразности. Метаболические топливные элементы с альгинатным покрытием хранились при 4 °C до имплантации.

Схема управления питанием

Для метаболического топливного элемента была разработана схема управления питанием для сбора энергии, повышения напряжения и высвобождения энергии для активации синего светодиода или электрического поля при уровнях глюкозы в крови выше 10 м м. Схема управления питанием состояла из зарядного устройства с низким энергопотреблением (BQ25504 Texas Instruments; Digi-Key Inc., кат. № Q25504RGTT), подключенного к конденсатору емкостью 330 мкФ (Panasonic, танталовый конденсатор; кат. № 10TPB330M, неэлектрический), который заряжался от метаболического топливного элемента для получения конечного выходного напряжения 4,2 В от зарядного устройства с низким энергопотреблением. Принципиальная схема схемы управления питанием показана на рисунке S6, вспомогательная информация.

Характеристика Метаболического топливного элемента

Морфология анода и катода была охарактеризована с использованием полевой эмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FESEM; FEI Versa 3D Dualbeam, ThermoFisher Scientific) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM; FEI Tecnai G2 Spirit, ThermoFisher Scientific). Кристаллическую структуру метаболического топливного элемента анализировали с использованием монокристаллического дифрактометра (Bruker Kappa Apex II, Bruker corporation, Биллерика, Массачусетс, США), настроенного на Ка-излучение Cu (λ = 1,542 Å). Циклическая вольтамперометрия, поляризационные кривые, спектроскопия электрического импеданса и потенциал разомкнутой цепи метаболического топливного элемента были проанализированы в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS; pH 7,4) при 37°C. CD, OCV и PD были рассчитаны на основе площади поверхности анода. Для электрохимических измерений в качестве эталона использовался электрод Ag/AgCl, а в качестве противоэлектрода использовалась платиновая проволока. Мощность рассчитывалась в соответствии со следующим уравнением (1):P=V×I(1)где P - мощность (Вт), V - напряжение (В), а I - ток (А).

Культивирование и стимуляция электроβ- и iβ-клеток

_{Электро}β-клетки (чувствительные к электричеству β-клетки человека),^[7] и клетки iβ (индуцированное iPhone высвобождение инсулина в β-клетках),^[17] были моноклональными клеточными линиями, основанными на 1.1.E7,^[81] -нечувствительной к глюкозе линии клеток поджелудочной железы человека INS_Vesc,^[7] сконструирован для конститутивной экспрессии либо i) каналов Cav1.2 и Kir2.1, способствующих быстрому высвобождению везикулярного инсулина в ответ на электрические поля,^[7], либо ii) меланопсина GPCR сетчатки, запускающего быстрое высвобождение везикулярного инсулина в ответ на синий свет.^[17, 18] Обе клеточные линии культивировали в среде Мемориального института Розуэлла Парка 1640 (RPMI; кат. № 72400-021, ThermoFisher Scientific) с добавлением 10% в/в фетальной коровьей сыворотки (FBS, кат. № F7524, лот № 0001638271; Sigma-Aldrich) и необязательно 1% в/в раствора пенициллина/стрептомицина (P/ S, 100 Ед. мл^-1 пенициллина и 100 мкг мл^-1 стрептомицина; кат. №15140-122, лот № 147173; ThermoFisher Scientific). Для электростимуляции на лунку 6-луночного планшета, содержащего 1, высевали 1× 10 ⁵ _{электро}β-клеток.4 мл культуральной среды и культивировали в течение 24 ч, прежде чем подвергать электростимуляции в течение указанных периодов времени с использованием крышки C-образной чашки (IonOptix Inc.). Пары углеродных электродов были помещены в культуральную среду^[7] и подключены к метаболическому топливному элементу (4,2 В) для стимуляции. Для оптогенетической стимуляции клетки 1,5 × 10⁴ iβ высевали в лунку 96-луночного планшета, содержащего 100 мкл клеточной культуральной среды, и культивировали в течение 24 ч, прежде чем их освещали в течение указанных периодов времени с помощью совместимого с 96-луночным планшетом светодиода синего света (475 нм, кат. № B56L5111P; Roithner Lasertechnik GmbH) крышка матрицы,^[7], питается от метаболического топливного элемента (4,2 В). Уровни инсулина были профилированы в указанные моменты времени после стимуляции с использованием сверхчувствительного анализа ELISA (cat. № 10-1247-01; Mercordia).

Микрокапсулирование электроβ- и iβ-клеток

Для защиты _{электро}-β- и iβ-клеток человека от иммунной системы мыши, обеспечивая при этом свободную диффузию питательных веществ и терапевтических белков, таких как инсулин, использовалась технология инкапсуляции на основе альгината, подтвержденная клиническими испытаниями и лицензированная FDA.^[80] Перед микрокапсулированием клетки _{электро}β и iβ выращивали до 80% слияния в стандартной среде для культивирования (DMEM, 10% FBS), трипсинизировали и ресуспендировали при 3,5× 10 ⁷ клеток на мл в буфере 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS) (10 мm MOPS, 0,85 NaCl, рН 7,2). _{Электро}β- и iβ-клетки были микрокапсулированы в когерентный альгинат-поли(Микрокапсулы из альгината (l-лизин) (PLL) (500 клеток в капсуле) диаметром 400 мкм путем смешивания 7 × 10⁷ клеток с 12 мл альгината (кат. № 11061528; Büchi AG), 200 мл 0,05% раствора PLL (кат. № PLKB50, Alamanda Polymers). Для герметизатора (B-395 Pro, Büchi AG) были установлены следующие параметры: сопло диаметром 200 мкм с частотой вибрации 1000 Гц, шприц объемом 25 мл, работающий со скоростью потока 20 мл в минуту^-1 и 1.Напряжение 2 кВ для рассеивания шариков. После сбора капсулы повторно суспендировали в течение 10 минут в 200 мл 0,05% раствора PLL, чтобы обеспечить дополнительный слой PLL для улучшения биосовместимости.

Эксперименты на животных. Экспериментальный диабет 1 типа

Мышей с диабетом 1 типа (T1D) получали путем инъекции 8-недельным самцам мышей C57BL/6JRJ дикого типа C57BL/6JRJ (25 g, Janvier Labs) внутрибрюшинно (IP) в течение 4 дней подряд стрептозотоцина (STZ; 50 мг кг^-1, 0,2 м цитратного буфера, рН 4,2; кат. № S0130, Sigma-Aldrich) после голодание в течение 6 часов.^[82] Контрольные животные, не страдающие диабетом, получали инъекции без STZ. Через 1 неделю статус СД1 в группе, получавшей STZ, был подтвержден количественным определением стойкой гипергликемии натощак с использованием клинически лицензированных тест-полосок ContourNext и считывателя ContourNext ONE (Ascensia Diabetes Care; кат. № 84191451 и 85659367 соответственно).).

Имплантация микрокапсулированных клеток и метаболический топливный элемент

Мышам выбривали дорсальную и дорсовентральную стороны, а животных анестезировали с использованием 4% изофлурана и поддерживали под 2% изофлураном во время хирургических вмешательств. Микрокапсулированные клетки имплантировали подкожно путем инъекции (0,5 мл DMEM, 5 × 10 ⁶ _{электро}-β или iβ-клеток, 500 клеток на капсулу) с дорсальной стороны с помощью стандартного шприца объемом 5 мл, оснащенного иглой 21 калибра, которая стратегически размещала клетки в области чуть ниже шейных позвонков, чтобы минимизировать асептическое разрыхление микрокапсулированных клеток. После стабилизации мышей в течение 6 ч метаболический топливный элемент имплантировали через хирургический разрез подкожно на дорсовентральной стороне и подключали либо проводными платиновыми электродами непосредственно к имплантированным _{электро} β-клеткам для стимуляции, опосредованной электрическим полем, либо к синему светодиоду (475 нм, кат. № B56L5111P, Roithner LaserTechnik GmbH) для прямого освещения имплантированных клеток iβ с расстояния 5 мм. Уровень глюкозы в крови определяли с использованием лицензированных клинически тест-полосок ContourNext и считывателя ContourNext ONE (Ascensia Diabetes Care; кат. № 84191451 и 85659367 соответственно), а уровни инсулина в крови определяли количественно в сыворотке, собранной в пробирки-сепараторы для сыворотки (центрифугирование 10 мин, 6000 × g; кат. № 365967, Becton Dickinson), используя сверхчувствительный анализ ELISA (кат. № 10-1247-01, Меркордия,).

Лицензии на эксперименты на животных

Все эксперименты на животных были одобрены властями кантона Базель-Штадт, Швейцария (номер лицензии: 2996_34477) и проводились P.G.R. (номер лицензии: LTK 5507) на кафедре биосистемной науки и техники (D-BSSE) ETH Цюрих в Базеле, Швейцария.

Статистический анализ

Все наборы данных были проанализированы с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 8.4.3, Ла-Хойя, Калифорния, США) после проведения двустороннего t-теста ANOVA. Критерием достоверной разницы между наборами данных был р < 0,05. Все данные экспериментов представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD) для n = 3 или n = 5, как указано в условных обозначениях рисунка.

Благодарности

Авторы благодарят Мари-Дидье Хусшерр за поддержку в экспериментах на животных и Хенрика Зулевски, а также Ану Пальму Тейшейру за щедрые советы. Эта работа была финансово поддержана через расширенный грант Европейского исследовательского совета (ElectroGene, № 785800) и частично Швейцарским национальным центром компетенций в области исследований (NCCR) в области молекулярной системной инженерии. Д.М., П.Г.Р. и М.Ф. разработали проект, проанализировали результаты и написали рукопись. Д.М., П.Г.Р. и М.М. проводили эксперименты in vitro. П.Г.Р. проводили эксперименты на животных. П.Б. спроектировал и изготовил силовую схему.

Финансирование открытого доступа предоставлено Высшей технической школой Цюриха.